پروتئن‌کینازهای یوکاریوتی، پروکاریوتی و آرکئی‌ها از یک ابرخانواده مشابه هستند (Leonard, Aravind et al. ۱۹۹۸). نقش فسفردار شدن پروتئین در باکتری‌ها بسیار مطالعه شده است و اهمیت آن شبیه سلول‌های یوکاریوتی است (Kobir, Shi et al. ۲۰۱۱). اما فسفردار شدن پروتئین در آرکئی‌ها خیلی مطالعه نشده است (Aivaliotis, Macek et al. ۲۰۰۹).
فسفردار شدن پروتئین در سرین، ترئونین و تیروزین فرایندهای پیام رسانی سلولی مختلفی را تحت تاثیر قرار می‌دهد. پروتئین‌کینازها این فعالیت را انجام می‌دهند که جهت تنظیم فرایندهای سلولی مانند سوخت و ساز، تقسیم و مرگ برنامه ریزی شده سلولی ضروری است. این خانواده بزرگ آنزیمی دومین‌های کاتالیتیکی مشابهی و سازوکار پیش ماده مشترکی دارند که می‌تواند علی رغم تنوع در توالی دارای تشابه باشد (Blom, Gammeltoft et al. ۱۹۹۹).
۱-۴-۳- قنددار شدن
در سال‌ها اخیر اثبات شده است که پروتئین‌های بسیاری می‌توانند توسط روش‌های غیر آنزیمی قنددار شوند (Perejda and Uitto 1982). گلوکز می‌تواند به آرامی با گروه‌های آمینی پروتئین مجتمع شود و در ابتدا یک باز شیف^[۱۵۰] ایجاد می کند که سپس ممکن است در قالب ترکیب آمادوری^[۱۵۱] بازآرایی شود (Wolff, Jiang et al. ۱۹۹۱). این مرحله ابتدایی واکنش قنددار شدن غیر آنزیمی نام دارد (Roth 1983). ترکیب آمادوری سپس به ترکیبات آلفاکتوآلدهید همانند ۱و۳-دی‌اکسی‌گلوکوزون^[۱۵۲] تجزیه می‌شود (Wolff et al. 1991). این ترکیبات ثانویه بسیار فعال‌تر از مونوساکاریدهای مادری هستند (George Njoroge, Sayre et al. ۱۹۸۷, McLaughlin, Pethig et al. ۱۹۸۰) و می‌توانند با پروتئین‌ها جهت تشکیل اتصالات عرضی مانند ترکیبات میلارد^[۱۵۳] یا محصولات نهایی پیشرفته قنددار شدن^[۱۵۴] (AGE) (Baynes and Monnier 1989) که باعث قهوه‌ای شدن پروتئین می شود ترکیب شوند (BROWNLEE, VLASSARA et al. ۱۹۸۴).
ترکیب کتوآمین ایجاد شده در واکنش گلوکز با پروتئین، محصول اولیه مجموعه‌ای از واکنش‌ها به نام واکنش‌های میلارد یا واکنش قهوه‌ای شدن^[۱۵۵] می‌باشد. این فرایند شامل بی‌آب شدن، بازآرایی و واکنش‌های تجزیه‌ای است که به واسطه آن مولکول‌های گلوکز متصل شده به پروتئین می‌توانند توسط گروه لیزین تعویض شده‌اشان و یا دیگر آمین‌ها جهت تشکیل قندهای چندتایی مجتمع شوند (Cohen Margo P 1988). چنین مشتقات گلوکزی دارای اتصالات عرضی محصولات نهایی پیشرفته قنددار شدن (AGE) نام می‌گیرند (Bunn, Haney et al. ۱۹۷۶).
شواهدی که نشان می‌دهد مرحله اول این واکنش در موجودات زنده رخ می‌دهد از مطالعه هموگلوبین‌های کوچک^[۱۵۶] که در در دیابت افزایش می‌یابند، به دست آمده است (Trivelli, Ranney et al. ۱۹۷۱). سپس احیاء بروهیدرید ^[۱۵۷] هموگلوبین باعث شد تا پایداری محصولات آمادوری و شناسایی و اندازه‌گیری آن ممکن شود (Bookchin and Gallop 1968). میزان قنددار شدن هموگلوبین اکنون به عنوان یک فهرست انباشتی گلیسمیا^[۱۵۸] در هفته‌های قبل از مدیریت بالینی افراد دیابتی استفاده می‌شود (Kennedy and Baynes 1984).
۱-۴-۳-۱- قنددار شدن در افراد دیابتی‌
خون افراد دیابتی دارای هموگلوبین غیر طبیعی است که نسبت به هموگلوبین در الکتروفورز یا کروماتوگرافی کربوکسی‌متیل‌سلولز^[۱۵۹] سریع‌تر حرکت می‌کند (Trivelli et al. 1971). اندازه‌گیری این پروتئین و دیگر پروتئین‌های قنددار شده سیستم گردش خون در روش‌های پزشکی جهت کنترل قند بیماران دیابتی استفاده می‌شود . علت این امر این است که قنددار شدن به غلظت گلوکز محدود شده به مکان پروتئین در زمان حضورشان در گردش خون وابسته است (Cohen Margo P 1988).
یک پیامد اصلی و عمده هیپرگلیسمیا (افزایش قند خون)، قنددار شدن مضاعف غیر آنزیمی است و یا برهم‌کنش غیرآنزیمی گلوکز و پروتئین می‌باشد . این قنددار شدن در ادامه باعث ایجاد بسیاری از اثرات ثانویه در افراد دیابتی از جمله تخریب‌های بافتی است (Brownlee, Cerami et al. ۱۹۸۸).
گرچه شیمی واکنش قنددار شدن غیرآنزیمی در ابتدا برای گلوکز و هموگلوبین شرح داده شده ولی اکنون روشن شده است که دیگر پروتئین‌ها زمانی که در معرض غلظت افزایش یافته گلوکز باشند نیز دچار قنددار شدن مضاعف می‌شوند.به صورت مکرر در آزمایشگاه و در شرایط موجود زنده نشان داده شده است که ناهنجاری‌های عملکردی بسیاری در ارتباط با قنددار شدن افزایش یافته پروتئین‌های متعددی وجود دارد (Cohen Margo P 1988).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱-۴-۳-۲- قنددار شدن کلاژن
پروتئین‌های کلاژن^[۱۶۰] دارای لیزین و هیدروکسیل لیزین بسیار و نیمه عمر طولانی هستند که در معرض سطوح محدود گلوکز در اجزاء رگ‌دار مایع خارج سلولی می‌باشند. در افراد دیابتی یک قنددار شدن ۲ تا ۳ برابری کلاژن مشاهده می‌شود (Cohen Margo P 1988).
در میان اثرات ناشی از قنددار شدن کلاژن می‌توان به مقاومت به هضم آنزیمی کلاژناز^[۱۶۱] (HamLin, Kohn et al. ۱۹۷۵)، تداخل در تشکیل اتصال عرضی (le Pape, Guitton et al. ۱۹۸۱)، تغییرات فیزیکی-شیمیایی مانند پایداری گرمایی و قدرت انبساط (Guitton Jean-Dominique, Le Pape et al. ۱۹۸۴, Guitton JD, Le Pape et al. ۱۹۸۱) و تشکیل اتصالات عرضی غیر عادی بین اجسام قنددار شده (Andreassen and Oxlund 1985, Kohn, Cerami et al. ۱۹۸۴) اشاره کرد.
۱-۴-۳-۳- قنددار شدن فیبرونکتین^[۱۶۲]
قنددار شدن غیر آنزیمی فیبرونکتین که یک گلیکوپروتئین^[۱۶۳] ماتریکس خارج سلولی است، شامل اثر بر اتصال سلول- پیش ماده و اتصال به کلاژن و گلیکوزآمینوزگلیکان‌هایی^[۱۶۴] مانند هپارین^[۱۶۵] می‌شود. اتصال این پروتئین‌ را به هپارین مهار می‌کند، توانایی آن را در اتصال به کلاژن دناتوره شده (ژلاتین^[۱۶۶]) کاهش می‌دهد و اتصال فعل و انفعالی^[۱۶۷] با هپارین و ژلاتین برقرار می‌کند (Cohen Margo Panush and Ku 1984, Tarsio, Wigness et al. ۱۹۸۵) و تصور می‌شود که در افراد دیابتی، قنددار شدن مضاعف فیبرونکتین باعث ایجاد ویژگی‌های چسبندگی و خودتجمعی می‌شود (Cohen Margo P 1988).
۱-۴-۳-۴ قنددار شدن لیپوپروتئین کم چگال^[۱۶۸] (LDL)
قنددار شدن مضاعف لیپوپروتئین کم چگال (LDL)، باعث افزایش ابتلا به بیماری‌های قلبی عروقی در افراد دیابتی می‌شود. شواهد این اتفاق از مطالعاتی که نشان می‌دهد که قنددار شدن اتصال، داخل شدن^[۱۶۹] و تجزیه LDL را کاهش می‌دهد به دست آمده است (Cohen Margo P 1988). پاک‌سازی کاهش یافته LDL قنددار شده در برابر LDL طبیعی هم نشان داده شده است (Lorenzi, Cagliero et al. ۱۹۸۴, Steinbrecher and Witztum 1984). نتیجه این کاهش برداشت وابسته به گیرنده و تجزیه آن، کاهش میزان LDL در پلاسما خواهد بود. علاوه بر این VLDL و LDL قنددار شده فعالیت بتاهیدروکسی‌متیل‌گلوتاریل‌کوآنزیمA ردوکتاز^[۱۷۰] و یا استیل کوآنزیمA کلسترل‌استیل‌ترانسفراز^[۱۷۱] را تغییر نمی‌دهند و به دلیل اینکه این آنزیم‌ها توسط LDL طبیعی به ترتیب مهار و ترکیب می‌شوند، این باور ایجاد شده است که توزیع القاء شده توسط قنددار شدن در داخل شدن وابسته به گیرنده LDL می‌تواند با تغییر درون سلولی کلسترول^[۱۷۲] و تولید آن تداخل ایجاد نماید (Cohen Margo P 1988).
۱-۴-۴- استری کردن^[۱۷۳]
استری کردن یک تغییر شیمیایی است و ثابت شده است که جهت بررسی گروه‌های کربوکسیل پروتئین‌ها مفید است. لازم به ذکر است که به دست آوردن روشی جهت تغییر تنها یک نوع از زنجیره‌های جانبی اهمیت بسیاری دارد و از این رو استری کردن روش مهمی است (Wilcox 1967).
استری کردن یک روش مهم برای دست‌ورزی پروتئین‌ها است. اساس واکنش به این ترتیب است که استری کردن با الکل‌های مختلف باعث مسدود شدن گروه‌های کربوکسیل می‌شود و بنابراین بار خالص مثبت و شاخصه بازی پروتئین را افزایش می‌دهد (Halpin and Richardson 1985, Mattarella, Creamer et al. ۱۹۸۳). پروتئین‌های استری شده بار مثبت افزایش یافته‌ای را نشان می‌دهند، زیرا تعداد گروه‌های کربوکسیل قابل یونیزه آن‌ها کاهش می‌یابد (Halpin and Richardson 1985).
روش مرسوم جهت جهت استری کردن شامل سه مرحله اساسی می‌باشد. مرحله اول مخلوط کردن مواد واکنش‌دهنده (الکل، اسید و پروتئین) است. مرحله دوم نگه‌داری به مدت چند روز در دمای ۴ می‌باشد. مرحله آخر هم پایان واکنش و بازیابی محصول می‌باشد که گاهی با واکنش‌های جانبی همراه است (SITOHY MAHMOUD, CHOBERT et al. ۲۰۰۰). تیمار پروتئین با متانول-HCl یک مزیت دارد و آن این است که تمامی و یا اغلب گروه‌های کربوکسیلی می‌توانند استری شوند (Wilcox 1967). گرچه استری کردن اسیدآمینه‌های غیر ضروری در اولویت است، زیرا ارزش غذایی پروتئین با دست‌ورزی اسیدآمینه‌های ضروری کاهش می‌یابد (Halpin and Richardson 1985).
میزان استری شدن به غلظت اسید، پروتئین، محتوای آب و همچنین نوع الکل مورد استفاده بستگی دارد. غلظت اسید و پروتئین متغیرهای بسیار مهمی هستند. غلطت پروتئین (۴تا۵%) به همراه نسبت مولی نه تنها باعث افزایش استری شدن می‌شود، بلکه سرعت واکنش را نیز افزایش می‌دهد (SITOHY MAHMOUD et al. 2000).
این دست‌ورزی تاخوردن و شکست پپتیدی پروتئین را تحت تاثیر قرار می‌دهد (BRIAND, CHOBERT et al. ۱۹۹۵). برای مثال BLG مقاوم به شکست پپتیدی در شرایط آبی است، ولی BLG اتیله شده بسیار به شکست پپتیدی حساس است (SITOHY MAHMOUD et al. 2000). BLG استری شده ۲۲ مکان هضم پپسینی جدید (BRIAND et al. 1995) در مقایسه با پپتیدهای به دست‌آمده از BLG طبیعی (Dalgalarrondo, Dufour et al. ۱۹۹۵) نشان می‌دهد. از این رو این واکنش می‌‌تواند روش مناسبی برای هضم پروتئین‌ها و یا تولید پپتیدهای جدید با فعالیتی تازه باشند (SITOHY MAHMOUD et al. 2000). از طرفی نقطه ایزوالکتریک بالای پروتئین‌های استری شده، می‌تواند آن‌ها را دارای خصوصیات فیزیکی-شیمیایی جدیدی سازد (Bertrand-Harb, Chobert et al. ۱۹۹۱, Mattarella and Richardson 1983).
۱-۵- خواص ضدویروسی BLG استری شده
دو مکانیسم اصلی ضد ویروسی پیشنهاد شده برای این مشتقات شامل برهم‌کنش با گیرنده‌های سطح سلول میزبان است که مکان اتصال ویروس‌ها هستند و راه دوم اتصال مستقیم به اجزاء ویروسی و جلوگیری از جذب آن‌ها توسط سلول هدف می‌باشد. از آن‌جا که این مشتقات دارای بار مثبت افزایش یافته شده‌اند، امکان اتصال با اجزاء دارای بار منفی را پیدا می‌کنند که برای مثال با اتصال به ژنوم ویروس مانع همانند سازی آن می‌شوند. علاوه بر بار خالص مثبت عوامل دیگری از قبیل آب گریزی، اندازه مولکولی و توزیع فضایی اسیدآمینه‌های باردار و آب گریز به نظر می‌رسد که در خواص ضد ویروسی موثر باشند. علاوه بر این انتظار می‌رود که این بار مثبت ایجاد شده نقش مهمی را در برهمکنش‌‌‌‌‌‌‌ با پروتئین و ژنوم ویروس ایفا کند( Sitohy Mahmoud, Billaudel et al. ۲۰۰۷).
این خواص ضد ویروسی BLG استری شده به غلظت BLG استری، غلظت ویروس و مدت زمان آلودگی وابسته استو علاوه بر این موارد این مشتقات می‌توانند جهت پروفیلاکسی و درمان آنفولانزا بدون در نظر گرفتن زیرگونه آن استفاده شوند( Sitohy Mahmoud, Besse et al. ۲۰۱۰).
۱-۶- اهداف این پژوهش
در این پروژه برآنیم که در مرحله اول با بهره گرفتن از امکانات موجود بهترین روش جداسازی و خالص سازی BLG را مشخص کرده و این پروتئین را به صورت خالص تهیه نماییم. در مرحله بعد BLG خالص شده را دست‌ورزی شیمیایی نموده و فرم‌های مختلف استری آن با الکل‌های متفاوت را تهیه کنیم. از آن‌جا که خواص ضدویروسی این مشتقات تا کنون اثبات گردیده است ولی گزارشی مبنی بر خواص ضد باکتریایی آن‌ها وجود ندارد، در نهایت برآنیم که خواص ضد باکتریایی احتمالی این مشتقات را بر روی سویه‌های مختلف باکتری مورد ارزیابی قرار دهیم.
فصل دوم
مواد و روش‌ها
۲-۱- وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده
دستگاه‌های مورد استفاده در این پژوهش از تجهیزات موجود در آزمایشگاه‌ دانشکده‌های زیست‌فناوری و شیمی دانشگاه اصفهان بوده که در جدول ۲-۱ فهرست آن‌ها آمده است.
جدول ۲-۱ فهرست دستگاه‌ها و وسایل مورد استفاده به همرا شرکت سازنده آن‌ها