۳-۵-۱-۱۱-استخراج پلاسمید از کلنی‌های نوترکیب
پس از مشاهده باند ۱۵۰۰ نوکلئوتیدی در تصویر ژل‌آگارز ۱% پس از الکتروفورز، برای سویه از ویال‌های دارای پلاسمید حاوی توالی، از فریزر ºC70- خارج شد و lμ ۵۰۰ از آن‌ها درml 20 محیط LB مایع همراه با آمپی‌سیلین µg/ml100 تلقیح شده و تا رسیدن به OD حدود ۵-۵/۱ در شیکرانکوباتور ºC37 گرماگذاری شد. استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت High pure plasmid isolation kit (Roche) طبق مراحل زیر انجام شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۱- انتقال ml 1 از کشت باکتری به یک ویال تمیز و سانتریفوژ برای ۳۰ ثانیه در rpm 8000
۲- حل کردن رسوب باکتری در µl 250 از بافر تعلیق^[۶۲] حاوی RNase که در یخچال نگه‌داری می شود
۳- افزودن µl 250 از بافر لیزکننده^[۶۳] به ویال و سروته کردن ویال به آهستگی
۴- انکوباسیون ویال به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق
۵- افزودن µl 350 از بافر اتصال^[۶۴] سرد به ویال و سروته کردن ویال به آهستگی. افزودن این بافر باعث تولید رسوب سفید رنگ می شود.
۶- انکوباسیون ویال به مدت ۵ دقیقه در یخ و سانتریفوژ به مدت ۱۰ دقیقه در rpm13000
۷- انتقال مایع رویی به تیوب فیلتردار^[۶۵] و سانتریفوژ به مدت ۶۰-۳۰ ثانیه در rpm13000
۸- دورریختن محلول زیری و افزودن lµ۵۰۰ از بافر شستشوی ۱^[۶۶] و سانتریفوژ با شرایط قبلی
۹- افزودن lµ ۷۰۰ از بافر شستشوی ۲ و دو بار سانتریفوژ با شرایط قبلی
۱۰- انتقال فیلتر به یک ویالml 5/1 تمیز
۱۱- افزودن lµ ۱۰۰-۵۰ از بافر انحلال^[۶۷] و سانتریفوژ با شرایط قبلی
۱۲- شستشوی مجدد فیلتر با همان بافر انحلال و سانتریفوژ مجدد
مایع زیری، پلاسمید استخراج شده می‌باشد. برای تایید فرایند استخراج و اطمینان از عدم شکستگی آن، lµ ۲ از محصول استخراج پلاسمید برای الکتروفورز با ژل‌آگارز ۸/۰% مورد استفاده قرار گرفت. در چاهک کناری نیز lµ۲ پلاسمید برش داده نشده برای مقایسه، بارگذاری شد.
۳-۵-۱-۱۲- توالی یابی پلاسمیدهای نوترکیب
پس از اطمینان از صحت انجام فرایند استخراج، lµ ۴۰ از هر یک از نمونه‌ها برای توالی‌خوانی با پرایمر عمومی^[۶۸] M13F به شرکت ماکروژن کره ارسال شدند.
۳-۵-۱-۱۳-بررسی نمونه‌های تعیین توالی شده
توالی­ها توسط نرم­افزارChromas pro بررسی شده و نهایتا میزان تشابه با باکتری­ های دیگر در پایگاه Eztaxone بررسی شد.
۳-۶-روش اندازه ­گیری آهن دوظرفیتی و آهن سه ظرفیتی
در این پژوهش برای اندازه ­گیری آهن کل و آهن دوظرفیتی از روش تیتراسیون استفاده شد، که در این روش ml 2 از محلول مورد آزمایش با دی­کرومات پتاسیم N1/0 تیتر شد، به این صورت که ml2 از محلول را به درون بشر ریخته شد، سپس بشر را بر روی همزن گذاشته و از بالا محلول دی­کرومات کم کم اضافه گردید، از روی حجم مصرفی دی کرومات می­توان میزان آهن دو ظرفیتی را اندازه گیری کرد، برای سنجش آهن کل با مقادیر بالای ۱% از روش تیتراسیون مانند آهن دو ظرفیتی استفاده گردید با این تفاوت که آهن کل یک مرحله احیاء توسط کلرید قلع دارد، به این صورت که ابتدا میزان آهن­های سه ظرفیتی موجود در محلول توسط کلرید قلع به آهن دو ظرفیتی احیاء شد، بعد از آن محلول حاصل را بر روی استیرر گذاشته و مانند سنجش میزان آهن دو ظرفیتی، دی کرومات به آن افزوده و از روی حجم مصرفی دی­کرومات میزان آهن کل اندازه ­گیری گردید (Penev Kalin, 2010).
۳-۷-تعیین pH مناسب برای اکسیداسیون آهن
اکسیداسیون آهن یا همان تبدیل آهن فروس به آهن فریک تحت تآثیر شرایط مختلف از جمله pH می­باشد، به این منظور در ارلن­های ۲۵۰ میلی لیتری از باکتری کشت داده شده در محیط کشت ۹K با درصد حجمی ۵% به محیط کشت­هایی با pH های، ۱، ۱٫۵، ۲، ۲٫۵و ۳ تلقیح گردید و در دمای C⁰34 با دور شیکر rpm150 قرار گرفت. هر دو روز یکبار به میزانml 4 از نمونه­ها برای اندازه گیری Fe⁺² و Fe total برداشته شد.
۳-۸-تعیین دمای بهینه برای اکسیداسیون آهن
به منظور بررسی دمای بهینه رشد باکتری میزان اکسیداسیون آهن، در سه دمایC⁰ ۲۸، C⁰32، ۳۷،C⁰40C⁰ بررسی شد. ارلن­های حاوی ml100محیط کشت، با درصد تلقیح ۵% باکتری، در شیکرانکوباتورهایی با دماهای بالا قرار داده شد، هر ۴ روز ml3 از ارلن­ها برای سنجش میزان آهن فریک و ml1 برای بررسی میزان رشد باکتری برداشته شد.
۳-۹-تعیین دانه بندی مناسب
دانه بندی یکی از پارامترهای مهم در فرایند فروشویی میکروبی می­باشد، به این دلیل که در دانه بندی­های بزرگتر از دانه بندی بهینه، سطح تماس باکتری به فلز کم شده و در دانه­بندی­های کوچکتر از دانه­بندی بهینه باکتری در اثر ضربات دانه­ها به دیواره از بین می­رود. از این رو در این پژوهش میزان اکسیداسیون آهن با پنج دانه بندی متفاوت بررسی گردید. ارلن­های ml250 حاوی ml100 محیط کشت که شامل ۵% باکتری و درصدجامد(پالپ) ۵% از نمونه با دانه بندی­های مختلف، mμ۴۵، mμ۷۵، mμ۱۰۶،mμ۱۲۶ وmμ۱۵۰، در شیکر انکوباتور با دمای C⁰40 و pH 5/1با دور شیکرrpm 150 قرار داده شد.
۳-۱۰-تأثیر میزان درصد پالپ
برای انجام این مرحله ارلن­های ml250حاوی ۱۰۰ml محیط کشت که درصد پالپ های مختلف ۲٫۵%، ۵%، ۷٫۵%،۱۰% و ۱۵% در شیکر انکوباتور با دمای C⁰40 و دور شیکر ۱۵۰rpm قرار داده شد و در فواصل زمانی ۴ روزه میزان آهن اکسید شده توسط دستگاه atomic absorbtion اندازه ­گیری گردید.
۳-۱۱-نگهداری سویه­ها در بانک میکروبی
اولین گزارش­های مربوط به نگهداری باکتری­ های شیمیولیتوتروف اکسیدکننده فلزات به حدود ۳۵ سال پیش بر می­گردد. و روش­ها و پروتوکل­های مربوط به نگهداری آنها روز به روز گسترش یافته است. روش­هایی مانند خشک کردن در انجماد، نگهداری از طریق گلوتامات مونو سدیم و بتائین گلی سین به کار رفته است. اما با بهره گرفتن از این روش­ها زمان نگهداری باکتری­ های دخیل در لیچینگ و یا تعداد آن­ها کم می­گردید و نگهداری آنها در زمان­های طولانی میسر نمی­گشت. بنابراین نگهداری باکتری­ ها در نیتروژن مایع به همراه گلیسرول و DMSO بهترین روش پیشنهاد شده برای نگهداری این دسته از باکتری­هاست (WU Xue-ling, 2013)، به همین دلیل از روش نگهداری در نیتروژن مایع برای نگهداری باکتری­ های جدا شده استفاده شد.
۳-۱۱-۱-نگهداری به روش نیتروژن مایع
بعد از کشت باکتری در محیط کشت اختصاصی ۹K استریل شده، از مایع نگهدارنده استفاده شد.
این مایع شامل: گلیسرول۱۰% + DMSO که گلیسرول را به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کرده و سایر مواد با فیلتر کردن به گلیسرول افزوده گردید.
سلول­های باکتری بعد از طی مرحله فاز نمایی و رشد کردن در دمای اتاق به مدت ۳۰ دقیقه قرار داده تا ذرات حاصل از اکسیداسیون آهن و سایر ذرات ته نشین شود. سپس محیط به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۰۰۰۰ rpm در دمای C⁰4 سانتریفیوژ شد.
۳-۱۱-۲- نگهداری در نیتروژن مایع و بازیابی از نیتروژن مایع
در ابتدا،ویال­های باکتری در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ تا ۴۰ دقیقه قرار داده شد. سپس ویال­ها به دمای ۲۰- درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ ساعت و بعد از آن به دمای C⁰70- به مدت ۲ ساعت. و در نهایت در نیتروژن مایع فریز شدند.
۳-۱۲-رسم درخت فیلوژنی
آنالیز فیلوژنیک سویه منتخب با ترتیب بندی توالی سویه­ها با توالی­های مرتبط با آن جنس با بهره گرفتن از نرم افزار ClustalX انجام گرفت. درخت فیلوژنی پس از مرتب کردن توالی ژن ۱۶srDNA گونه­ های نزدیک به این جنس در نرم افزار ClustalX با بهره گرفتن از نرم افزار Mega version5 رسم شد. بررسی اعتبار شاخه­ های درخت با بهره گرفتن از نرم Bootstrap analysis صورت گرفت(محمدی­پناه،۱۳۸۶).
فصل چهارم
نتایج
نتایج
۴-۱-نمونه برداری
نمونه گیری به روش استاندارد انجام گردید، جدول (۴-۱) خصوصیات و ویژگی­های نمونه­های گرفته شده را نشان می­دهد. جدول ۴-۱) خصوصیات محل­های نمونه گیری