۱۰۰ میلی گرم از برگ تازه گیاه مورد نظر در یک میکروتیوب ۵ /۱ قرار داده شد و با بهره گرفتن از ازت مایع برگ پودر شد.
۷۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج که از قبل گرم شده به میکروتیوب اضافه شد.
میکروتیوب به حمام آب گرم C°۶۵ برای مدت ۳۰ دقیقه انتقال داده شدند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

پس از اندکی سرد شدن ۶۰۰ میکرولیتر از کلروفرم، ایزوآمیل الکل (۱: ۲۴)، به میکرو تیوب اضافه شده و بر روی شیکر افقی به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق تکان داده شدند.
میکروتیوب ها در سرعت ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه برای مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شدند.
رونشین برداشته شده و به میزان هم حجم ایزوپروپانول سرد به میکروتیوب اضافه شد. میکروتیوب چند بار سروته شدند.
برای مدت ۸ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شدند، رونشین ریخته شده و میکروتیوب روی دستمال کاغذی به صورت وارونه برای مدت ۱۰- ۵ دقیقه قرار داده شدند.
۳۰۰ میکرولیتر از اتانول ۷۰% اضافه شد تا نمک های باقی مانده از بافر استخراج حذف شوند و پلت DNA شستشو شود.
میکروتیوب به مدت ۸ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شدند.
رونشین دور ریخته شده و میکروتیوب با قرار دادن به صورت وارونه در دمای محیط خشک شدند.
۶۰ میکرولیتر از بافر TE (8PH mM 10) به میکرتیوب حاوی DNA اضافه شده و میکروتیوب به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت تا DNA کاملا حل شود.
۳-۴-۲ واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای تایید وجود ژن WDREB2 در گیاهان تراریخت
به منظور تائید تراریختی گیاهان و وجود ژن WDREB2 در آنها از واکنش زنجیره ای پلیمراز با آغاز گرهای اختصاصی ژن nptII استفاده شد. در این واکنش پلاسمید دارای ژن WDREB2 به عنوان کنترل مثبت و گیاه گندم غیر تراریخت به عنوان کنترل استفاده شدند. مواد مورد استفاده در واکنش و چرخه حرارتی طبق جدول ۳-۱ استفاده شد. پس از اتمام واکنش، محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی ژل آگارز ۱% رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید الکتروفورز شد تا از وجود قطعه مورد نظر اطمینان حاصل شود.
۳-۴-۳ استخراج RNA
به منظور حذف آنزیم RNase قبل از شروع استخراج RNA کلیه وسایل مربوطه از قبیل ویال، تیپ، هاون، فالکون را در اتوکلاو به مدت ۴۵ دقیقه ضدعفونی (bake) کرده و تمام محلول های مورد استفاده از قبیل اتانول ۷۵ % با آب تیمار شده با DEPC تهیه شدند.
به منظور تهیه آب تیمار شده با DEPC، ماده DEPC و آب را به نسبت ۱ به ۱۰۰۰ مخلوط نموده و آن را به مدت ۳ تا ۴ ساعت در دمای اتاق قرار داده و آن را چند بار تکان داده تا کاملا مخلوط شود سپس آب را اتوکلاو نموده تا ماده سمی DEPC به مواد غیر سمی تبدیل شود.
استخراج RNA با بهره گرفتن از کیت(-Plus) RNX^TM شرکت سیناژن طبق مراحل زیر انجام شد:
۱۰۰ میلی گرم از بافت برگ گیاه مورد نظر وزن شد.
برگ گیاه در هاون دارای ازت مایع به خوبی خرد شد، سپس به ویالml 5/1 که از قبل سرد شده بود انتقال داده شد و به آن ۱۲۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج X- Plus اضافه شد و بعد از آن مخلوط گیاه و بافر در ویال ورتکس شد تا بافت گیاهی کاملاً هموژنیزه شود.
۲۵۰ میکرولیترکلروفرم به میکروتیوب حاوی بافت هموژنیزه شده اضافه و به مدت ۳۰-۱۵ ثانیه میکروتیوب با دست به آرامی سر و ته شد.
نمونه به مدت ۵ دقیقه در یخ قرار داده شد.
نمونه به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفوژ شد.
فاز رویی (رونشین) به یک ویال ۵/۱میلی لیتر جدید انتقال داده شد و به میزان هم حجم آن ایزوپروپانول سرد به آن اضافه و به آرامی به مدت ۲۵-۱۵ ثانیه سروته شد.
نمونه به مدت ۱۵دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه در ۴ درجه سانتی گراد سانتریفوژ شد.
مایع رویی دور ریخته شده و به میزان ۱ میلی لیتر از اتانول ۷۵% به آن افزوده و به آرامی تکان داده و سپس ورتکس شد.
۸ دقیقه با سرعت ۷۵۰۰ دور در دقیقه در °C4 سانتریفوژ شد.
مایع رویی دور ریخته شده و میکروتیوب در شرایط محیط خشک شد.
۵۰ میکرولیتر آب دارای ۱میلی مولار EDTA به میکروتیوب اضافه شد و به مدت ۱۰-۵ دقیقه در دمای ۵۵-۶۰ درجه سانتیگراد قرار داده شد تا RNA کاملاً حل شود.
به منظور حذف آلودگی ژنومی ‌RNA های استخراج شده از آنزیم DNase I شرکت فرمنتاز^[۱۰۷] استفاده شد. مواد موجود در جدول ۳-۵ با هم مخلوط گردید و به مدت ۳۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس ۱۰ میکرولیتر EDTA با غلظت ۲۵ میلی مولار اضافه شد و به مدت ۱۰ دقیقه در ۶۵ درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از استفاده از DNase، کیفیت و کمیت RNA ها با بهره گرفتن از ژل آگاروز یک درصد (حجمی/ وزنی) و دستگاه نانودراپ تعیین شد (جدول ۳-۴).
جدول ۳-۴- نوع و میزان مواد بکار رفته برای تیمار DNase